Por Real Cédula del 29 de agosto de 1563, Felipe II creó la gobernación del Tucumán, Juríes y Diaguitas, sustrayéndola de la jurisdicción de Chile y poniéndola bajo la dependencia del Virreinato del Perú en lo político y de la Real Audiencia de los Charcas en lo judicial. Para entonces, en este gran territorio que comprendía las actuales provincias de Córdoba, La Rioja, Catamarca, Santiago del Estero, Tucumán, Salta, Jujuy y parte de las de Chaco y Formosa, había solo una ciudad, Santiago del Estero, la más antigua del actual territorio argentino, que sobrevivía sólo gracias al coraje y tenacidad de sus vecinos.
Las otras que hasta poco antes existían (Londres, Cañete, Córdoba del Calchaquí y Nieva), fundadas en tierras del dominio del poderoso cacique don Juan Calchaquí gracias a la amistad que logró tejer con él Juan Pérez de Zurita, habían sucumbido por la torpeza de su sucesor, el gobernador Gregorio de Castañeda. Durante una discusión que mantuvo con el cacique, este oscuro personaje le propinó una bofetada que dio lugar a una feroz invasión de los diaguitas que mataron a sus vecinos y destruyeron las cuatro ciudades y mataron a sus vecinos.
El primer gobernador efectivo del Tucumán, Tucumán— nombrado interinamente por el virrey del Perú, conde de Nieva, Nieva— fue el célebre Francisco de Aguirre,''la primera lanza de Chile'', quien hizo el tercer traslado de la ciudad de El Barco cambiando su nombre a Santiago del Estero. Una de sus primeras disposiciones fue enviar a su sobrino Diego de Villarroel a fundar una nueva ciudad ''en el campo que llaman en lengua de los naturales Ibatín, ribera del río que sale de la quebrada'', río hoy llamado río Pueblo Viejo o río del Tejar. Villarroel fundó el 31 de mayo de 1565 la ciudad de San Miguel de Tucumán y Nueva Tierra de Promisión en el sitio indicado, probablemente el mismo en donde habían estado Cañete y la primitiva Barco, en el lugar conocido como la Quebrada del Portugués y a unos sesenta kilómetros 60 km al sur de su actual ubicación.
A Aguirre le sucedieron como gobernador gobernadores don Jerónimo Luis de Cabrera, luego fundador de la ciudad de Córdoba, y Gonzalo de Abreu de Figueroa, (que hizo matar a su predecesor sin causa justificada). Durante su mandato Abreu despobló las ciudades de Santiago del Estero, San Miguel y Córdoba para hacer una campaña en busca buscar el oro de la mítica ciudad de los Césares. Esto provocó que San Miguel fuera atacada en la noche del 28 de octubre de 1578 por indígenas diaguitas, solcos y juríes, comandados por el yanacona Galuán, un gigante con fama de feroz guerrero. La ciudad fue incendiada, quedando rodeados en la plaza el teniente de gobernador Gaspar de Medina y otros dos españoles. Estos se defendieron con denuedo, logrando Medina en un acto de arrojo matar a Galuán, cortándole cortar la cabezade Galuán. Esto atemorizó a los indios que , a la llegada de otros vecinos , emprendieron la huída. Abreu de Figueroa recibió en Soconcho una carta de Medina relatándole lo ocurrido y envió en su socorro al maestre de campo Hernán Mejía Mirabal, quien pudo devolver devolvió la paz a San Miguel.
La tercera y última guerra de Calchaquí —provocada por las intrigas del impostor andaluz Pedro de Bohórquez, que levantó en armas a los indios proclamándose heredero del trono inca— afectó severamente a la ciudad. A ello se sumó la aparición de enfermedades endémicas como el paludismo y trastornos tiroideos por la escasez de yodo del agua del río del Tejar, que además cambió su curso y produjo grandes inundaciones. Por ésto el gobernador don Juan Díez de Andino solicitó al rey, en 1680, autorización para trasladarla. Obtenida la venia real, su sucesor don Fernando de Mendoza Mate de Luna la reubicó en su locación actual, a unos 64 kilómetros al noreste de Ibatín, en el sitio conocido como La Toma. La mudanza la hizo en setiembre de 1685 el teniente de gobernador,Miguel de Salas y Valdés.
En Ya en su nuevo sitio, San Miguel de Tucumán comenzó a cobrar relevancia hasta convertirse en una de las ciudades más importantes del actual territorio argentino. El censo, dispuesto —dispuesto por Carlos III el 10 de noviembre de 1776 y realizado en el actual territorio argentino entre 1778 y 1779, 1779— le asigna entonces 20.074 habitantes, resultando la tercera en población después de Córdoba (46.509) y Buenos Aires (37.130).