Antes de Houssay no existía la dedicación exclusiva a la investigación y los profesores de la Facultad de Medicina atendían también sus consultorios privados, lo que Houssay nunca hizo. La investigación biológica, en particular, era prácticamente inexistente. Como no era de familia rica y en esa epoca no habían subsidios millonarios para la investigación, eligió temas de estudio que no requerían instrumentos complejos ni grandes gastos operativos. Usó sapos para sus experimentos, animales abundantes y baratos de obtener, en especial el ''Rhinella arenarum''[http://www.iucnredlist.org/apps/redlist/details/54576/0] (antes denominado ''Bufo arenarum''). Sus discípulos y colaboradores coinciden en recalcar su dedicación obsesiva al trabajo y su firme decisión de continuarlo en el país pese a las grandes carencias y dificultades materiales.
Uno de sus principales temas de investigación fue el papel de la hipófisis en el metabolismo de los hidratos de carbono y el aparente antagonismo entre ella y el páncreas. La extirpación de la adenohipófisis producía una lenta absorción intestinal de los hidratos de carbono y el animal era incapaz de mantener niveles adecuados de azúcar en sangre durante el ayuno. Houssay demostró que los animales a los que se extirpaba la hipófisis eran extraordinariamente sensibles a la acción hipoglucemiante de la insulina —pequeñas —pequeñas dosis de insulina que no afectaban a los animales normales mataban a los que no la tenían— tenían— y que esa sensibilidad se debía a la falta de la hormona de crecimiento somatotrofina. Experimentos hechos por Houssay y Biasotti en 1930 mostraron que la hipofisectomía total o la ablación de la adenohipófisis del sapo atenuaban la diabetes al disminuir el ascenso de la glucosa sanguínea, mientras que la implantación del lóbulo anterior hacía recuperar o superar la intensidad habitual de la diabetes. Los experimentos que demostraron la acción diabetógena de la hipófisis fueron luego extendidos por Houssay a mamíferos como el perro, para el cual pudo descartar la influencia de otras glándulas endócrinas. Sus trabajos sobre la influencia de la adenohipófisis sobre el metabolismo de los hidratos de carbono le valieron el Premio Nobel de Medicina de 1947, compartido con Carl Ferdinand Cory y su esposa Gerty Theresa Radnit. Este premio puso a Argentina en el mapa mundial de la Fisiología.